乙肝病毒表面抗原检测
一．HBsAg实验操作步骤：
此次征兵体检所采用的试剂盒是英科新创试剂盒，具体步骤如下：
1. 平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，待平衡至室温后（约半小时），方可开启使用。
2. 配洗液：按1：19比例用蒸馏水或去离子水溶解配制。
3. 编号：将微孔条固定于支架上，按序编号。
4. 加样：分别加入阴、阳性对照50ul，待测血清样品50ul于相应孔中。阴性对照设2孔，阳性对照设2孔（采用单波长酶标仪时应设空白对照1孔，即不加样品及酶标记抗体，其余步骤相同），室内质控1孔，加量50ul。
5. 加酶：分别在每孔中加入酶联试剂50ul，轻轻混匀。
6. 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。
7. 洗涤：用PBST洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30秒～60秒的浸泡时间）。
8. 显色：每孔加显色剂A、B各50ul，轻轻混匀，暗置37℃15分钟。
9. 终止：每孔加终止液50ul，轻轻混匀。
10.测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成，并记录结果)。
11.结果判定：
临界值(C.O)＝阴性对照孔OD均值N×2.1
样品OD值S/C.O≥1者为HBsAg阳性(或S/N≥2.1)
样品OD值S/C.O＜1者为HBsAg阴性(或S/N＜2.1)
(阴性对照孔OD值大于0.1时应重新实验，小于0.05时以0.05计算)
二、HBsAg检测中应注意的问题
1．实验前戴好手套，注意检验操作人员自我保护。
2．包被之微孔板从冰箱取出，应置室温（18℃～25℃）放置20分钟以上，使之室温平衡，潮气散尽后才能开密封包装袋。未使用完之微孔板连同干燥剂应及时放入凹凸封袋中，并封好，即时存入4℃冰箱。
3．标本若不能当天检测应及时分离血清并编号，存入4℃冰箱，以防溶血。若超过一周才检测的样本应将血清放-20 ℃以下冰箱保存，以防污染或细菌生长所致效价下降。
4．加酶试剂应使用定量移液器加液，以保证加量准确。
5．温孵前，应检查温箱的温度是否符合要求。用恒温水浴箱温孵时微孔板应漂浮在水面，不可脱离水面；如果用干温孵箱温育，请将微孔板置于温度计附近的环境中，保证温度准确。
6．洗涤是ELISA操作中的重要环节，清洗干净是保证质量的关键。 手工洗涤时各孔均须加满洗液并浸泡 30-60秒，防止孔口内有游离酶未能洗净；采用洗板机时，应注意调节洗液量至孔口。
7．比色前应先用柔软洁净的吸水纸拭净微孔板底附着的液体或指印，然后将微孔板正确放入酶标仪的比色架中，酶标仪不应安置在阳光或强光照射处，使用前先预热仪器15分钟，测读的结果更稳定。
8．重视检验结果的计算，是保证结果正确的前提，应按试剂盒说明书中的计算公式计算，不得自行制定判定结果标准。
9．所有的样品及一次性耗材都应按传染源消毒处理(包括阴、阳性对照品)。
三、征兵体检对HBsAg项目要求：
1．要做好室内质控。每次实验时，每块微孔板都应附HBsAg(2IU/ml)质控血清同时检测，质控血清检测结果须有效，否则应重新实验。
2．实验报告单应签上操作者姓名，以示负责。做好检验结果记录，兵检结果应专门登记，并附有酶标仪检测原始记录。
3．检测完毕的血清或血浆样本应置-20℃以下环境保存，留样6个月。
4．初次检测阳性结果的标本应进行双孔复检，复检结果为阳性，方可报告阳性，防止由于污染造成的假阳性。
5．应每天观察水浴箱、温孵箱和试剂存放冰箱的温度是否在要求范围。
6．实验操作者应坚持原则，忠实于实验结果，不得弄虚作假。
梅 毒 螺 旋 体 抗 体 检 测
一、梅毒螺旋体的抗原性及梅毒螺旋体抗体
1．梅毒螺旋体抗原：
通常检测的梅毒抗体有两种类型，一是梅毒螺旋体的体表蛋白抗原，为蛋白多糖复合物，该抗原具有种和型的特异性，为特异性抗原，能同相应抗体发生凝集反应；另一是螺旋体抗原，存在螺旋体内部，是类脂质多糖复合物，该抗原无种和型的特异性，为非特异性抗原，具有广泛的交叉反应，与螺旋体属中各群之间均出现交叉反应，同螺旋体以外的病原体也出现交叉反应。
非特异性抗原刺激人体产生非特异性抗体，是一种抗类脂质抗体称为反应素，该抗体在一期梅毒阶段即增加，二期梅毒达到高峰，三期梅毒时部分会逐渐降低。
二、梅毒抗体检测：
1．特异性抗体检测：目前主要有TPHA、TPPA、TP-ELISA等方法。
2．非特异性抗体检测：目前多用TRUST、RPR、USR等方法。
三、TRUST检测：
本次征兵体检要求检测梅毒非特异性抗体，使用英科新创（厦门）科技有限公司TRUST试验盒。此项体检是对定兵后的兵员进行。
1．原理：采用类脂质抗原重悬于含有特制的甲苯胺红溶液中制成，类脂质抗原能与患者血清或血浆中的反应素形成凝集反应，与甲苯胺红共同形成肉眼可见的凝集颗粒。
2．检测步骤：
⑴准备：待检血清或血浆和TRUST抗原于用前置23℃~29℃平衡20分钟；
⑵加样：取待检血清或血浆（不需灭活）50μl和阴性及阳性对照各50μl分别均匀涂满1个卡圈内；
⑶加抗原试剂：轻轻摇动TRUST抗原使之均匀，以试剂盒中专用滴管垂直滴加抗原1滴于血清卡圈内；
⑷混旋：用梅毒旋转仪或手工水平转动纸卡，每分钟100转，转动8分钟后，立即于光线充足处肉眼判定结果，三分钟内完成；
⑸结果判定：
阳性反应：凡肉眼可见的凝集，不论凝集强度如何，均判为阳性反应；
阴性反应：无凝集物可见或在溶液中出现点状红色颗粒，摇动时均匀分散无凝集，判为阴性反应。
⑹注意事项：
a．试验应在23℃~29℃条件下进行；
b．TRUST抗原久置易沉淀，使用前应先摇匀；每盒试剂使用前应用阳性血清对照验证，结果异常时应停止使用。
c．抗原自冰箱取出后要于23℃~29℃环境中平衡后再用，抗原滴加前用滴管反复吹吸数次；
d．实验时应防止其它病毒感染，卡片一次性使用；
e．本试验为非特异性反应素试验，可能出现生物学假阳性，见表1；
f．本试验为初筛试验，结果阳性时，应重复试验，重复结果仍为阳性，应进行确认试验（TPHA和TPPA试验），并将初筛试验结果与确认试验结果一并报告主检医生。
g．每次实验时，应附梅毒（初筛）临界浓度（2NCU/ml）质控品，保证检验质量。
h．检验报告单应有检验者及审核者签署姓名，检验结果应做好登记，以备查核。
i．检验后的样品血清或血浆应做好唯一标识，置-20℃以下冰箱保存6个月。
j．检验操作时实验人员应戴手套；实验后废物应按有关规定处理，切勿随意丢弃。
k．本试验可能存在“前带现象”，如遇弱阳性样本或可疑样本应进一步做定量试验，如血清稀释后，反应不增强，判为阴性，反之报告阳性。
3．临床意义：见表2。
表1 生物学假阳性疾病的分类及发生率
类别 | 病名 | 阳性率（100%） |
急性传染病 | 疟疾 | 100 |
| 斑疹伤寒 | 20 |
| 牛痘 | 20 |
| 回归热 | 30 |
| 猩红热 | 20 |
| 巨细胞病毒肺炎 | 20 |
慢性传染病 | 麻风 | 60 |
| 性病性淋巴肉芽肿 | 20 |
| 乙型肝炎 | 10 |
其它 | 系统性红斑狼疮 | 20 |
表2梅毒抗体临床意义
RPR/TRUST | TPHA/TPPA | 临床意义 |
— | — | 排除梅毒或初期感染（潜伏期） |
+ | — | 假阳性或初期感染 |
— | + | 梅毒治疗或晚期梅毒 |
+ | + | 梅毒感染 |
HIV 抗 体 检 测
一、HIV抗体的检测：本次征兵体检是使用上海科华公司双抗原夹心法（两步法）试验盒。此项体检要求对定兵后的兵员进行。
1．原理：采用HIV特异性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体与固相化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况下，产生显色反应。
2．操作步骤：
⑴平衡：将试剂盒平衡至室温，酶标板须室温平衡后，方可开封，余者连同干燥剂即时封存。
⑵配液：PBST浓缩液用蒸馏水或去离子水1:25稀释使用。
⑶编号：取所需数量微孔板条固定于支架上，按序编号。
⑷加样：按顺序分别在相应孔加入100μl待测样本。每块微孔板应设阴性2孔，每孔100μl；阳性对照3孔、每孔100μl；空白对照2孔（不加样本和酶结合物）、室内质控1孔，加量100μl。
⑸温育：覆盖粘胶纸封板后置37℃温育60分钟。
⑹洗涤：小心将粘胶纸揭掉，吸干板内液体，将洗涤液注满每孔（约300μl）充分洗涤5遍，最后一次在干净纱布上尽量扣干。
⑺加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
⑻温育：用粘胶纸封板后置37℃温育30分钟。
⑼洗涤：同步骤⑹。
⑽显色：每孔加底物缓冲液50μl、TMB 50μl，混匀，37℃显色10分钟。
⑾终止：每孔入终止液50μl，轻拍混匀。
⑿测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm（用单波长测定时，以空白对照孔调零），读取每孔吸收值（加终止液后，务必15分钟内读数完毕）。
3．结果判断
抗HIV阳性对照值＞0.8，抗HIV阴性对照值＜0.08。
临界值(C.0.)=阳性对照值×10%（若阳性对照值＞2.5按2.5计算）。
结果判定： 样本OD值≤临界值(C.0.)者为HIV抗体阴性；
样本OD值＞临界值(C.0.)者为HIV抗体阴性
注意：初试阳性者应重新取样双孔复试，复试阳性者应按“全国HIV检测管理规范”，送HIV确认实验室进行确认试验！
4．注意事项：
⑴本试剂的使用单位必须是当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。
⑵必须符合HIV实验室管理规范和生物安全守则的规定，严格防止交叉感染，检验操作时实验人员应戴手套，穿工作衣，严格执行消毒隔离制度，实验后废物及废液应按有关规定处理，切勿随意丢弃、排放。
⑶HIV抗体结果的判定必须以酶标仪读数为准。
⑷标本和酶结合物均应用加样器加注，并经常对其准确性。
⑸酶标板须密封防潮，从冷藏环境中取出时，应置室温平衡至潮气尽干后方可开封启用。余者并干燥剂即时放入自封袋中保存。
⑹加试剂前，应先将瓶子翻转数次，使液体混匀。
⑺洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净，每遍洗涤浸泡时间为30秒～60秒。
⑻每次实验时，应附HIV临界浓度（2NCU/ml）质控品，保证检验灵敏度。
⑼本试验为初筛试验，结果阳性时，应重复试验，重复结果仍为阳性，应送HIV确认实验室进行确认试验！
⑽封板膜为一次性用品，不能重复使用。
⑽检验报告单应有检验者及审核者签署姓名，检验结果应做好登记，并附酶标仪打印原始记录，以备查核。
⑾检验后的样品血清或血浆应做好唯一标识，置-20℃以下冰箱保存6个月。
5．临床意义：
本试验为初筛试验，所以本试验结果阳性者，必须再做HIV抗体确认试验，最终以确认试验结果作为HIV感染的依据。
血清丙氨酸氨基转移酶速率法
标准操作程序及注意事项
福建省临床检验中心 王友基
一．标准操作程序
1实验原理和检验目的
本试剂用于测定人血清中丙氨酸氨基转移酶的酶活浓度。
L-丙氨酸 +α-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸
丙酮酸 + NADH + H+ LDH L-乳酸 + NAD+ + H2O
在340纳米处测定NADH吸光度的下降速率，可计算出ALT的活力。
2标本采集和处理
标本：新鲜无溶血血清。
受检者（体检对象）的准备：对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯。
静脉采血：体位影响水分在血管内外的分布，一般在采血时取坐位。
标本要放在带盖的容器内以防污染和蒸发，要求是新鲜无溶血的血清，样品采集后要及时离心标本，吸出血清,并立即检测，处理样品时要将其当成生物污染品。
试剂 | 主 要 成 分 | 实验浓度 |
R1 | L-丙氨酸 乳酸脱氢酶（LDH） | 500mmol/L ≥5000U/L |
R2 | NADH α-酮戊二酸 | 0.18mmol/L 15mmol/L |
包装规格： 有以下几种：
R1：80ml×2；R2：20ml×2
试剂为液体双试剂，开瓶即可使用，用后及时置于2～8℃避光保存。
3.3试剂稳定性
原装试剂在2～8℃避光保存，稳定期12个月，试剂开瓶载机2～8℃稳定30天。
新打开试剂不宜与已用过的试剂混合在一起,否则易造成试剂稳定性下降。
每日进行试剂空白校准操作，用蒸溜水当作样本进行检测。
推荐校准周期为30天一轮，当试剂批号更换时应重新校准。
应采用省临床检验中心配发的 （正常范围质控）和 （病理范围质控）两个水平的血清进行室内质控。
质控物的检测值应在给定质控范围，及通过参加省临床检验中心室间质评对实验室的运作情况进行系统评价。
每日进行样本检测之前首先应进行质控操作，以考察检测系统的在控情况。如果检测结果符合质控要求则进行样本操作；如果不符合质控要求，则应重复质控操作，以排除可能发生的偶然误差；如果仍不符合质控要求，则应考虑质控品的重新准备、试剂的重新校准或更新、仪器的维护等，建议在样本的检测过程中和/或结束后再次进行质控操作，以考察样本的检测全过程的在控情况。
6.1参数设定: 使用单位根据所用生化分析仪机型的与其相匹配试剂的参数进行验证或自行设置。
6.2仪器运行：根据各单位各自所用生化分析仪的标准运行步骤进行操作。
7计算方法
ALT (U/L)＝(△A样品/分－△A空白/分)×K
Vt
K = ×1000
Vs×消光系数
Vt = 反应总体积 Vs = 样品体积
8参考区间
男：≤40U/L
女：≤40U/L
9结果处理
对超出可报告范围的结果的处理：当△A/分大于0.190时，样品用生理盐水稀释后重新测定，结果乘以稀释倍数。
对检验结果为病危报警值的处理：应立即报告。
二．注意事项
1 方法局限性
试剂抗干扰能力：
当血清中抗坏血酸≤25mg/dl、血红蛋白≤200 mg/dl（使用血红蛋白纯品，非红细胞裂解液）、总胆红素≤40 mg/dl、结合胆红素≤40 mg/dl时，对测定无明显干扰。
2操作注意事项
(1)试剂空白吸光度小于1.000时，勿用。
(2)本产品仅用于体外诊断，内含防腐剂，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。
(3)本产品应在2～8℃条件下贮存。
3操作性能
选用三组血清进行批内精密度和日间精密度的检测，：批内精密度和日间精密度
3.3方法学比较
均符合要求。
三、征兵体检对血清丙氨酸氨基转移酶速率法检测的项目要求：
1．要做好室内质控，质控血清检测结果应符合要求，否则应重新检测.
2.应注意结果异常样本复检，防止由于污染或错误操作造成的假误差。
3．每次实验报告单应签上操作者姓名，结果应填报具体检测结果，不得填写正常或异常。应做好结果登记，检验结果应专门登记，并附有各种记录。
4．检测后的血清样本应留样6个月。
5．应每天观察仪器操作间的温湿度和试剂存放冰箱的温度是否在要求范围。
有关使用技术请与省临床检验中心联系。
五．注意事项
1．使用贝克曼全自动生化分析仪的参检单位，请使用统配的广州标佳贝克曼专用试剂，按仪器技术操作规范，直接上机检测。
2．使用德灵全自动生化分析仪的参检单位，请使用本单位现用的德灵专机专用试剂检测，不另外配发试剂。
